淺談影響熒光定量PCR實驗結(jié)果的幾大因素

首先什么是PCR呢？

PCR的全稱是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（英文全稱：Polymerase Chain Reaction），是一種體外酶促合成特異DN的方法，也可以稱作無細(xì)胞分子克隆或DNA序列體外引物定向酶促擴增技術(shù)。它不僅可用于基因分離，克隆和核酸序列分析等基礎(chǔ)研究，還可用于疾病的診斷或任何有DNA,RNA的地方。

PCR分為定性PCR和定量PCR兩類：定性PCR只能通過終點法對擴增產(chǎn)物進(jìn)行定性分析，而不能進(jìn)行定量分析；定量PCR能通過加入的熒光分子信號的變化來實現(xiàn)對PCR產(chǎn)物的實時檢測。相對來說，定量PCR的檢測靈敏度更高；特異性好，準(zhǔn)確性高；線性關(guān)系好，范圍寬；操作更簡單安全。

PCR實驗的基本因素及過程反應(yīng)成分：引物，酶，模板DNA，dNTP，Mg2+鎂離子濃度 。

反應(yīng)過程：1、模板變性；2、引物退火；3、新鏈延伸。

這三個步驟為一個循環(huán)，每一個循環(huán)度產(chǎn)物均可作為下一個循環(huán)度模板，經(jīng)過n次循環(huán)后，目的DNA以2n的形式增加。

除了以上五個主要因素外，還有實驗耗材因素和溫度因素：

1：首先PCR實驗試劑的總體積一般為25ul~100ul，因此所選用的耗材必須是吸附低的；

2：PCR實驗需要高溫解鏈，低溫合鏈，中溫延伸，因此要求所選用的耗材需要有很好的熱傳導(dǎo)率；

3：PCR實驗需要不斷的循環(huán)升溫，降溫，這就要求所選用的耗材必須有良好的氣密性；

4：PCR實驗還需要循壞的收集數(shù)據(jù)，需要選用的耗材有良好的均一性。

5：另外根據(jù)實驗使用儀器的不同，熒光定量實驗中熒光讀取方式不同，對耗材還有以下不同的要求：

  a:采用頂部熒光照射并于頂部回收熒光的儀器，要求管蓋或者封板膜必須是光學(xué)透光的性能，同時管壁最好選擇不透光材質(zhì)；

  b：采用側(cè)方熒光照射并于頂部回收熒光的儀器，要求管蓋或者封板膜必須是光學(xué)透光性，同時管壁也要是高透光的透明材質(zhì)；

  c：采用側(cè)方熒光照射并于側(cè)方回收熒光的儀器，要求管蓋或者封板膜最好選用不透光材質(zhì)，同時管壁選擇高透光的透明材質(zhì)。